急性胰腺炎与细胞凋亡

会计考友

　　细胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的细胞自主地有序死亡，又称程序性细胞死亡，是一种消灭不需要的和损害的细胞的生命调控过程。凋亡细胞形成凋亡小体很快被临近的细胞所吞噬，其特点是不引起炎症反应。机体以牺牲少部分细胞为代价换取整体的生存与稳定。急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）的发病机制尚未完全清楚，激活的胰蛋白酶对胰腺实质的自身消化是AP发生的重要病理过程。近年来，人们已注意到急性水肿型胰腺炎的胰腺中存在着较多的凋亡细胞，而急性坏死型胰腺炎（acutenecrotizingpancreatitis，ANP）却很少出现凋亡细胞。这就提示细胞凋亡在AP的发生和发展过程中起着一定作用。　　一、细胞凋亡的概念和检测方法　　细胞凋亡在生命过程中具有重要的生物学意义，它严格控制着细胞死亡和增殖的平衡。细胞凋亡的产生大体是细胞表面分子接受到诱导因子刺激后将信号传入细胞内部，触发了细胞内部的遗传机制，激活了核酸内切酶，使细胞染色质DNA降解。核酸内切酶的活性依赖细胞内高浓度的钙离子，钙离子达到最高水平的时间需要30～90min，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生调亡的一个重要条件。细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学、生物化学、细胞学及分子生物学方面的改变。其中最重要的特征之一就是凋亡细胞染色体基因组的片段化，是由依赖钙离子的核酸内切酶催化的，这种核酸内切酶的性质尚不清楚，但作用是十分肯定的。核酸内切酶将核小体间的连接部位切割成单链DNA片段，这种DNA片段的断裂不是随机的，而是185bp的倍数，这种片段化在琼脂糖电泳中表现为特殊的云梯状带型，据此可初步确定细胞凋亡的存在。细胞凋亡时染色体DNA会产生单链切口，因此设计了原位切口翻译及标记技术。凋亡细胞的细胞膜通透性增加，小分子DNA片段丢失，可用流式细胞术技术检测。　　1.形态学上的改变：胰腺炎时的胰腺凋亡细胞主要表现为有完整的细胞膜、胞核固缩、凋亡小体形成，线粒体和酶原颗粒完整。由于核小体DNA破裂成碎片，同焦点激光扫描显微镜观察到各种各样的三维结构。　　2.端口标记检测（triphosphate-biotinnick-endlabeling，TUNEL）：TUNEL广泛用于检测DNA碎片片段，该方法具有操作简单、结果特异性强、重复性好，特别对于低水平凋亡检测更敏感。kimura等用切除双侧肾上腺的大鼠诱导胰腺炎，采用半薄及超薄结构模式实施TUNEL和同焦点激光扫描显微镜检查，细胞凋亡的阳性结果是一致的。但在结扎胰胆管的模型中用TUNEL检测不出凋亡细胞，说明不同方式诱导出的胰腺炎模型对检测结果有影响。　　3.流式细胞术（flowcytometry）；发生凋亡的细胞在细胞学上有一系列特征性改变，所有这些有别于坏死等其它类型细胞死亡的特征都能利用流式细胞术技术进行研究，该技术即能为细胞是否发生凋亡提供客观依据，还能对细胞凋亡进行定量分析，因此它是研究影响细胞凋亡因素及作用机制的一种简单可行的方法。　　二、细胞调亡与胰腺坏死的关系　　在临床上，70%以上的AP为水肿型，坏死型胰腺炎中胰腺的坏死程度也存在着很大差异，多数为轻、中度坏死，仅少数患者迅速发展为大面积的或全胰坏死。很显然，AP发生后，最终相差悬殊的结果与多种因素有关，诸如致病原因、胰腺解剖的个体差异、胰腺本身的应激反应程度等。众所周知，不论何种胰腺炎，激活的胰蛋白酶对胰实质的自身消化是其共同途径，胰腺腺泡细胞的破坏程度与病变程度呈平行关系，那么什么因素进一步影响或制约着胰蛋白酶对胰实质的自身消化过程呢？很可能机体内存在着由基因控制的一种或多种调节因子，调节因子的作用之一就是调控了胰腺细胞的细胞凋亡，细胞凋亡程度影响着胰腺的坏死程度。1995年Kaiser等用4种不同方法诱导了鼠的ANP模型和1种水肿型胰腺炎模型，在每一种ANP模型中都出现了大量的坏死胰腺细胞，却很少有凋亡细胞；而水肿型胰腺炎仅有少量坏死细胞，却有大量凋亡细胞。据此，Kaiser等认为之所以发生ANP是没有细胞凋亡出现，水肿型胰腺炎未向坏死型发展是由于凋亡细胞对腺泡细胞具有保护作用。Saluja等用动物实验也证明了相似的观点，先用缺乏胆碱的饲料喂养小鼠，诱发出水肿型胰腺炎，然后用含胆碱的饲料喂养小鼠使其胰腺炎得以恢复，这样就可以诱发鼠胰腺腺泡细胞的凋亡，再向小鼠腹腔内注入大剂量的蛙皮素诱发AP，与对照组相比，血淀粉酶等生物化学指标差异无显著意义，但胰腺坏死程度却明显减轻。预先诱发的细胞凋亡能防止胰腺腺泡的损伤，减少ANP的发生。环乙酰亚胺能抑制核酸内切酶的活性，从而抑制细胞凋亡的发生。在结扎大鼠胰胆管的胰腺炎模型中应用环乙酰亚胺，与对照组相比ANP发生率明显增高。这一结果从另一角度证明细胞凋亡影响着胰腺的病变程度。但是，腺泡细胞过度凋亡会加重胰腺的损害。反复发作的慢性胰腺炎患者极少发展为ANP，ANP多为初次发病，这是人所共知的问题。是否慢性胰腺炎患者胰腺存在较多的凋亡细胞？凋亡细胞如何产生？产生时间、如何作用等都是需要进一步研究的问题。　　三、细胞调亡的调控与胰腺炎的防治
          　　细胞调亡是由基因控制的，在鼠的AP中，PC3/TIS21/BTG2基因是控制胰腺细胞调亡的重要基因。AP时细胞凋亡基因水平调控的研究很少，研究多集中在细胞因子上。AP病程中出现大量中性粒细胞的浸润及巨噬细胞的形成，产生了大量的细胞因子，如：肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNFα）、血小板激活因子（platelet-activatingfactor，PAF）及白介素等。这些细胞因子除参与内毒素血症形成外，还具有诱导、调控胰腺细胞凋亡的作用。其作用方式是多种多样的，依剂量及产生作用的时间不同，结果也完全不同。　　1.TNFα：TNFα与细胞凋亡的关系很密切，它可以诱导CD28分子的转基因表达而导致细胞凋亡；能诱导免疫缺陷病毒慢性感染的猫成纤维细胞发生细胞凋亡。在体外培养孵育的单个胰腺细胞，TNFα可通过胞膜上TNFα受体的55及75引起反应，形成NE-KappaB易位至细胞核诱发单个胰腺细胞凋亡。TNFα增加糖皮质激素受体的转录和受体的数量，影响蛙皮素诱导的鼠胰腺炎的细胞调亡。在蛙皮素诱导的胰腺炎中应用TNFα拮抗剂，抑制了胰腺细胞凋亡。脂多糖是革兰阴性细菌细胞膜的主要成分，用蛙皮素诱导鼠胰腺炎前，腹腔注入小剂量脂多糖（50　μg/kg）能诱导胰腺腺泡细胞调亡，减轻胰腺病变程度。其细胞调亡可能是通过TNFα诱导的。上述结果说明TNFα能诱导单个胰腺细胞和实验性胰腺炎的细胞凋亡。AP时，尤其是ANP早期即产生了大量的TNFα，在动物实验和临床都已证实TNFα明显增高会诱发内毒素血症、引发多器官功能障碍综合征，但此时TNFα并没有对胰腺起到保护作用，合理的解释是：ANP发生后，机体发生了剧烈地炎症反应，诱导细胞凋亡是一复杂过程，产生过量的TNFα对机体的损害大于保护作用。所以，TNFα如何诱导胰腺炎时胰腺细胞凋亡及其诱导过程等都是需要进一步研究的问题。　　2.中性粒细胞、PAF：中性粒细胞、PAF在AP的病理过程中起着重要作用。在蛙皮素诱导的胰腺炎，PAF是由胰腺腺泡细胞或导管细胞产生的，PAF具有活化中性粒细胞的功能。激活的中性粒细胞通过释放过氧化氢、一氧化氮等物质诱导细胞坏死或细胞凋亡而导致细胞死亡。在蛙皮素诱导的鼠胰腺炎，中性粒细胞可以转变凋亡细胞为坏死细胞，从静脉用抗中性粒细胞血清后，凋亡细胞增加而坏死细胞减少。同样在蛙皮素诱导的鼠胰腺炎，腹腔注入甲氨蝶呤抑制中性粒细胞的活性，与对照组相比细胞凋亡数增加了两倍，减轻了胰腺的损害。PAF具有双重作用，既能调节腺胞细胞凋亡，又能增强中性粒细胞的趋化性。用PAF拮抗剂（BN52021）治疗用蛙皮素诱导的鼠胰腺炎既减少了细胞凋亡，也减少了细胞坏死。　　3.p53的过度表达及临床意义：p53的生物化学功能是一种转录因子，在细胞的G1期监视细胞基因组的完整性。如果DNA遭到破坏，p53蛋白与之结合，直到损坏的DNA得到修复。如果修复失败，便有效地诱发细胞凋亡。在59%的胰腺炎患者和67%的胰腺癌患者中均有p53的过度表达。p53的过度表达是胰腺癌的标志物，同时也意味着存在慢性胰腺炎，所以不具有特异性。在慢性胰腺炎的DNA片段中存在着野生型p53，野生型p53是DNA损伤的细胞发生细胞凋亡时必不可少的信号，它使损伤的胰腺细胞进入G1期进行修复，并诱导不能修复的损伤细胞发生凋亡而不引起炎症反应。这为慢性胰腺炎反复发作却很少发生为ANP提供了一定的依据。其它的基因如：bcl-2、c-myc对胰腺炎时细胞凋亡的调节作用尚在研究中。　　总之，适度的细胞凋亡对AP时的胰腺腺胞细胞具有保护作用，炎症因子诱导细胞凋亡表现为双重作用。亚细亚蒿素（artemisiaasiatica）能诱导胰腺细胞凋亡而减轻实验性胰腺炎的病变程度，是目前唯一被证实是通过诱导胰腺细胞凋亡来治疗AP的药物。临床上尚无AP时细胞凋亡的研究报道，内源性糖皮质激素能降低胰腺的坏死程度，地塞米松、中药已用于治疗ANP患者，这些药物是否能诱导胰腺细胞调亡，需要进一步研究。目前，能阐述细胞凋亡对人胰腺炎的发展有影响的方法是：用已有的急慢性胰腺炎腊块标本，利用TUNEL检测凋亡细胞数量。但是，这项工作需要多家协作才能完成。?