2013微生物与寄生虫检验知识辅导：细菌感染的分子生物学检测

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　　（一）常用的分子生物学技术
　　1.核酸杂交 常用的杂交技术有：斑点杂交、southern印迹、原位杂交、Northern印迹等。探针的种类有全染色体DNA探针、染色体克隆片段DNA探针、质粒DNA探针、rRNA基因探针、寡核苷酸探针等。
　　2.核酸扩增技术 核酸扩增技术是分子生物学中最具有重大意义的技术之一。对核酸进行扩增的方法很多，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）、连接酶链反应、自保留序列扩增及Q-beta扩增等。以聚合酶链反应最为广泛应用。
　　PCR技术在细菌的快速检测、细菌的毒素基因检测、细菌的耐药性检测及感染细菌的流行病学调查中得到日益广泛的应用。
　　生物芯片是新近发展的一项对基因、蛋白质、细胞及其他生物组分进行大信息量分析的检测技术。常用的有基因芯片（gene chips）和蛋白芯片（protein chips）。目前正在研制和评价中。
　　（二）鉴定感染细菌种属的方法
　　1.细菌种属的鉴定
　　DNA碱基组成的测定 G+C mol%含量不同的细菌，为不同种细菌；含量相同的可能为不同种的细菌。细菌的G+C mol%相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。最常用的方法是热变性法。
　　DNA-DNA杂交 DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。
          
　　16S rRNA同源性分析 rRNA-DNA杂交、16S rRNA序列测定、16S-23S rRNA序列测定
　　此外限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机引物扩增法（RAPD）等技术常用于菌株间的差异比较。
　　2.细菌种属特异基因
　　某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这些基因的检测可以鉴定细菌的种或属。如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于伤寒沙门菌；IS6110、IS986插入片段为结核分枝杆菌复合群所拥有等。
　　3.细菌毒力基因
　　可以测定霍乱弧菌的霍乱毒素基因、产肠毒素大肠埃希菌的耐热（ST）和不耐热肠毒素（LT）以及白喉棒状杆菌的外毒素基因以示相应的细菌存在。
　　（三）细菌耐药性的分子生物学检测
　　1.β内酰胺类抗生素的耐药基因
　　青霉素结合蛋白（PBP）基因 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌是由mec A基因介导的耐药，肺炎链球菌对青霉素耐药是由于PBP基因突变而致。
　　革兰阴性菌产生的β内酰胺酶 由质粒介导的β内酰胺酶种类繁多，可以用PCR或基因探针的方法检测和分类，如TEM、SHV、OXA、ROB型等。
　　2.糖肽类抗生素耐药基因 肠球菌对糖肽类抗生素的耐药基因由Van A、Van B、Van C等介导，测定这些基因可以预测对万古霉素和壁霉素的耐药性。
　　3.大环内酯类抗生素耐药基因 红霉素甲基酶erm基因、大环内酯类泵出基因mef A、mef E、msr A等基因参与了红霉素的耐药。
　　4.喹喏酮类抗生素耐药基因 喹喏酮类抗生素的主要耐药机制是由于螺旋酶和拓扑酶的突变，常与gyr和par基因突变有关。
　　5.分枝杆菌耐药基因 对利福平的耐药与rpoB变异有关，对异烟肼的耐药与kat G和inh A有关。