2011微生物与寄生虫检验知识辅导：真菌检验技术的进步

会计考友

　真菌检验的临床重要性日益增加。传统的真菌培养和鉴定技术需时较长，且深圳特区部真菌感染的病原菌常不易培养成功，成为实验诊断的难点。
　　近年来，真菌感染的快速实验诊断技术正在努力解决这一问题。一、应用分子生物学技术自临床标本中检出真菌DNA；二、应用单抗和免疫学技术自临床标本中快速检出真菌抗原；三、利用真菌的特异性酶快速诊断真菌；四、常规培养与鉴定技术的进步，现分述如下。
　　一、常规分离、鉴定技术的进步
　　利用酵母样真菌在生长过程中形成的酶，作用于培养基中的色原底物，使菌落呈现不同的颜色，此种CHROMOAGAR的应用，利于快速分离与初步鉴定酵母样真菌。
　　酵母菌的常用鉴定系统已有以AP120C为代表的手工法，以ATB32C为代表的半自动法，以AMS为代表的自动代法借助于AMS的YBC卡的生化反应，应用人工双歧层次分析鉴定法可使鉴定正确率提高。
　　利用酵母菌生长过程中形成的予成酶作用于合成的色原底物而制成的成套微量鉴定系统Rap ID Yeastplus System，可于4小时完成酵母菌的快速鉴定，与应用API20C的一致率达97.3%.
　　平滑念株菌可利用其快速分解菌藻糖而迅速鉴定。用4%菌藻糖的0.1μmol/L枸橼酸缓冲液，取待鉴定菌落浓涂入液中，37℃温育3h，以尿葡萄糖试纸检测，如在2分钟内显色（阳性）即为平滑念珠菌。经与传统鉴定方法比较，此法的敏感性98.8%，特异性99.1%.
　　都柏林念珠菌的临床重要性在增长，其简易可靠的鉴定试验为该菌在42℃不能生长，且β-D葡萄苷酶为阴性。
　　二、自临床标本中直接检查抗原
　　深部真菌感染者血中难于培养出菌体，尤其是丝状真菌菌体常粘附、缠绕于组织，血中不易出现。但组织中菌体可溶性抗原可吸收入血自血、尿或感染组织液中直接检查真菌抗原为快速诊断的重要手段；虽也可检查抗体，但难达快速诊断。
　　（一）、检测念球菌属的甘露聚糖及其抗原
　　1.胶乳凝集试验
　　取300μl血清，加100μlEDTA处理液，混匀，煮沸3min，离心10000×g10min，取上清40μl加10μlSanofi胶乳粒子，3min内出现凝集为阳性。
　　2.EIA法。以单抗包被酶标板，用双抗体夹心法检查血清中念球菌抗原。
　　3.检测血中的白色念球菌的甘露聚糖抗体。ENA法检查中甘露聚糖对念珠菌感染的诊断敏感性40%，特异性98%，ENA法检查甘露聚糖抗体对念珠菌感染的诊断敏感性53%，特异性94%.
　　4.检查血清中D-阿拉醇或D-阿拉伯醇与L-阿拉伯醇的比值可快速诊断念珠菌病。Yeo等用基因重组的D-阿拉伯醇脱氢酶以酶荧光法定量，发现念珠菌感染者血清中来自菌体的D-阿拉伯醇明显升高，用此法迅速论断新生儿的侵袭性念珠菌病。
　　Mitsutake等比较了自39名深部念珠菌病患者血液中检出抗原的四种方法。应用斑点印迹法检查其烯醇化酶（Enlase）抗原的阳性率71.8%，特异性100%；应用胶乳凝集检查热敏性糖蛋白抗原阳性率76.9%，特异性87.5%；应用胶乳凝集检查甘聚糖抗原阳性率75.6%，特异性100%，应用鲎试试验检查细胞壁组分β-Glucan的阳性率84.4%，特异性87.5%.
　　（二）、肺曲菌病的血清抗原检查
　　1.胶乳凝集试验检查血清中半乳甘露聚糖。方法如上述胶乳凝集试验。
　　2.单抗ELISA法检查血清中半乳甘露聚糖抗原，敏感性达1.0ng/ml.
　　3.DELFIA法。Eu标记的时间分辨荧光分析法敏感性达0.5ng/ml.
　　（三）、血清中查组织胞浆菌抗原
　　以此菌荚膜的69-70kd抗原制出单抗以ELISA法检出可及时明确诊断。
　　（四）、尿中检查马尼菲青霉菌抗原
　　以该菌外壁的膜蛋白为抗原制出单抗，以ENA法诊断33例患者，52例健康人和248例无真菌感染的住院患者均为阴性。本法的特异性98%，敏感性97%，阳性予示值84%，阴性予示值99.7%.
　　（五）、新形隐球菌的抗原检查
　　新形隐球菌具有荚膜多糖抗原，可以单抗致敏的胶乳凝集试验快速检出。其荚膜多糖的主要成分为Glucuronoxy lomannan，以此抗原的单抗包被酶标板，以双抗体夹心法检出抗原，血清稀释1：8为阳性。Feldmesset用此法自AIDS患者引发新形隐球菌性脑膜炎的血清中检出抗原而及时诊断。
　　（六）、深部丝状真菌感染的抗原检查。
　　丝状真菌的细胞壁成分含（1→3）β-D葡聚糖，可用鲎试剂（鲎凝固酶）检出。以20μg/ml为界限值。文献报告检查41例深部丝状真菌感染者，37例阳性，敏感率90%，特异性100%.
　　三、检查真菌的特异性酶
　　白色念珠菌具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶和脯氨酸氨肽酶，如用适当底物检测，此两酶同时阳性，即可确定。都柏林念珠菌只具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶。克柔念珠菌具酸性磷酸酶，热带念珠菌具吡咯磷酸酶，平滑、副平滑念珠菌具β-D半乳糖苷酶，新形隐球菌具酚氧酶，均可用适当呈色底物快速完成鉴定。
　　四、分子生物学技术
　　（一）、用PCR等技术字标本中扩增真菌DNA.国内应用PCR与反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌主要种别。国外可以用PCR-DEIA技术从血清中扩增出白色念珠菌的DNA来诊断念珠菌病。
　　针对真菌的共同序列而设计的‘全能引物’而扩增580bp的产物，为真菌所共有。检测血液标本即可明确体内有无真菌感染。
　　（二）、用于真菌的型别分析。国内应用随机引物PCR扩增后进行真菌分型，结果可靠。应用随机引物扩增物多态性分析（RAPD）可以将5种曲霉菌鉴别开（烟、黄、黑、土、构巢曲霉）。国外结合PCR与酶标记探针在纸条上进行检测可鉴别出主要的致病性真菌。
　　（三）、检出念珠菌的基因变异快速确定念珠菌对酮康唑的耐药性。此种耐药性由基因的1554T突变为C而致，应用Lightcycler仪器，以荧光共振能量转移和基因片段溶解温度曲线技术测定。