比色法
& |& o8 \/ L& |3 N 1.原理 5 m! a3 P% M& U1 t% q
维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用,产生蓝色物质,其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定,但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。5 w% T7 A* ?- w0 g* J1 f
2.仪器 5 A# Y8 D7 C3 M, G& `( `" u: j4 C
实验室常用设备 分光光度计 回流冷凝装置# k; o/ n2 o- L& D- ?$ w! j. ]
3.试剂
* u Q9 }$ i7 L 本实验所用试剂皆为分析纯,所用水皆为蒸馏水 - P) v( f R- t+ t6 E" m& z- L
(1) 无水硫酸钠 Na2SO4
. u- O; N6 l" S- @2 @* M3 Y: ` (2) 乙酸酐 - w* m8 z8 H0 Z) |% N) R
(3) 乙醚 不含有过氧化物
- T; x+ ^3 H2 k (4) 无水乙醇 不含有醛类物质
9 F7 A( x" v: _/ S2 v (5) 三氯甲烷 应不含分解物,否则会破坏维生素A 4 L7 u0 A0 m% b3 B: ^3 u
检查方法:三氯甲烷不稳定,放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水振摇,使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液,如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。 " Z- d' W! J8 N4 g7 T" d
(6) 25%三氯化锑-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液,储于棕色瓶中(注意避免吸收水分) E# V' P. N. [' ?# ~. r
(7) 50%氢氧化钾溶液(KOH) W/V
& L: q9 Y: {8 h2 b7 m (8) 维生素A标准液 视黄醇(纯度85% Sigma)用脱醛乙醇溶解维生素A标准品,使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。 + K+ Y; ` p7 M: A* b7 k* k( Y% n
(9) 酚酞指示剂 用95%乙醇配制1%溶液
$ e& U% W; F- S8 o 4. 操作步骤
; H) H# y" Z2 s8 D- m8 o! O 维生素A极易被光破坏,实验操作应在微弱光线下进行。7 [0 B( c: Q- ?3 A
4.1样品处理:根据样品性质,可采用皂化法或研磨法。
8 N7 n& j7 I' c4 ]5 g) e) b (1)皂化法:
4 Z" t/ ~* O' g4 k4 t. ~' V+ p 皂化:根据样品中维生素A含量的不同,称取0.5g~5g样品于三角瓶中,加入20~40ml无水乙醇及10ml1:1氢氧化钾,于电热板上回流30min至皂化完全为止。(皂化法适用于维生素A含量不高的样品,可减少脂溶性物质的干扰,但全部实验过程费时,且易导致维生素A 损失) ; y7 X9 h8 c6 _3 \; [% Y. }
提取:将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中,以30ml水洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗。如有渣子,可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50ml乙醚分二次洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气,静置分层后,水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30ml乙醚分二次冲洗,洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后,静置分层,水层放入三角瓶中,醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。
: C ?8 g, I6 d: B; v洗涤:用约30ml水加入第一个分液漏斗中,轻轻振摇,静置片刻后,放去水层。加15 ~20ml 0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中,轻轻振摇后,弃去下层碱液,除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤,每次用水约30ml,直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止(大约洗涤3次)。醚层液静置10~20min,小心放出析出的水。 ; Y+ A$ x8 I1 R8 A! Q
浓缩:将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中,再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次,洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏,回收乙醚。待瓶中剩约5ml乙醚时取下,用减压抽气法至干,立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。来自www.Examw.com
# E/ X/ O, a) V0 @" H- L: L (2)研磨法: ( ~; l/ ^' y1 n7 B4 S D
研磨:精确称2~5g样品,放入盛有3~5倍样品重量的无水硫酸钠研钵中,研磨至样品中水分完全被吸收,并均质化。(研磨法适用于每克样品维生素A含量大于5~10μg样品的测定,如肝样品的分析。步骤简单,省时,结果准确)
7 k d$ H j- j M1 b( L3 J 提取:小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内,准确加入50~100ml乙醚。紧压盖子,用力振摇2min,使样品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清(大约需1~2h),或离心澄清(因乙醚易挥发,气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先置于冷水浴中)。 9 G0 l9 y! g6 n- C# z
浓缩:取澄清提取乙醚液2~5ml,放入比色管中,在70~80℃水浴上抽气蒸干。立即加入1ml三氯甲烷溶解残渣。
$ m- G/ a0 y+ T* N" | 4.2标准曲线的制备:准确取一定量的维生素A标准液于4~5个容量瓶中,以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1ml三氯甲烷和标准系列使用液1ml,各管加入乙酸酐1滴,制成标准比色列。于620nm波长处,以三氯甲烷调节吸光度至零点,将其标准比色列按顺序移入光路前,迅速加入9ml三氯化锑-三氯甲烷溶液。于6秒内测定吸光度,将吸光度为纵坐标,以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。
" }5 d! p2 H) a8 C 4.3样品测定:于一比色管中加入10ml三氯甲烷,加入一滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1ml三氯甲烷,其余比色管中分别加入1ml样品溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。
. y' Q" U7 o. [ U% S" u! z2 E8 l 6.计算 9 k1 V& S- Z/ e; H
X = C/m×V×100/1000;6 G8 B3 I3 A2 H6 @7 N, T. ], @. T: O
式中
: w) f3 s" d9 x( ]1 H X: 样品中含维生素A的量,mg/100g(如按国际单位,每1国际 9 O# }3 u7 J6 y' W @8 r! u
单位= 0.3μg维生素A); ) p) o6 V( L5 r' e( C5 u
C: 由标准曲线上查得样品中含维生素A的含量,μg/ml;
5 u* o! u! \6 q3 S, L8 P2 i" E# q m: 样品质量,g;
0 t% Z, @1 O) e/ |! Z V: 提取后加三氯甲烷定量之体积,ml; 9 q6 r' R# q. L3 d6 M2 j, ]
100: 以每百克样品计。 |