公共营养师(三级)考点辅导：维生素D的测定方法

会计考友

　　高效液相色谱法
　　1. 原理  
. E" _: ^/ l8 T　　样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱，紫外检测器定量测定。
2 \- `/ A$ }; @/ k6 ^4 @" I　　2. 适用范围  
　　本方法来源于GB/T 5413.9-1997。适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定；也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。
6 k! a9 y4 |& R5 ?. }4 O　　3. 主要仪器  
5 Z( x1 @1 l+ A( H　　1) 高压液相色谱仪，具有可变波长的紫外检测器，数据处理系统或记录仪。  
) k( f, q- c$ Y+ @- r( A& G8 q　　2) 旋转蒸发器。  
　　3) 平底烧瓶：250mL。
　　4) 分液漏斗：500mL。
, e4 [) C! @* z5 L2 c+ |2 G8 L! J　　4. 试剂  
% x: c: ^. m1 m6 r$ \　　所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所实验用水均指蒸馏水。
　　1) 异丙醇：色谱纯。  
　　2) 2％焦性没食子酸乙醇溶液：取2g焦性没食子酸溶液于100mL无水乙醇中。  
　　3) 75％氢氧化钾溶液：取75g氢氧化钾溶于100mL水中。  
　　4) 石油醚：沸程30～60℃。  
; c* l6 }1 w5 Y　　5) 甲醇：色谱纯。  
: {+ X! X  ?' F- t4 K  c- N　　6) 正己烷：色谱纯。  
. d: i: t6 ]  ?6 S8 |, ?0 e9 r, E　　7) 环己烷:色谱醇。  
　　8) 维生素D标准溶液  
　　A. 维生素D2标准贮备液：含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。  
　　B. 维生素D3的标准贮备液：含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
　　5. 操作步骤
+ r+ Q6 q9 H$ y' y7 s6 k　　5.1样品处理：准确称取10g样品，于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。
　　5.2测定液的制备：  
　　1) 于上述样品溶液中加入100mL的20％没食子酸乙醇溶液，充分混匀后加50mL75％氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上边续回流30min后，立刻冷却到室温。  
　　2) 将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。  
0 Q4 T$ \1 K0 P" y7 {　　3) 于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1 min.在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中，重复上棕萃取过程2次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近于（绝不允许蒸干）后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。  
　　4) 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中，用氮气将石油醚吹干，于试管中加1mL正己烷。
　　5.3测定：  
　　1) 测定液的制备：  
　　A) 仪器条件：  
- E/ _* u0 F9 \　　色谱柱：30cm×40cm，硅胶柱。  
+ H1 [4 ]) {' _. F7 [　　流动相：正己烷与环己烷按体积比1：1混合，并按体积分数0.8％加入异丙醇。  
　　流速：1mL/min。  
　　波长：265nm。  
　　柱温：20℃。  
7 w9 Z+ h9 i# k2 R+ p2 h　　灵敏度：0.005AU/MV。  
　　注射体积：200mL。  
　　B) 注射50mL维生素D标样和200mL样品溶液，根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解。  
　　2) 测定步骤：  
1 a9 r3 h0 y7 q* J　　A) 仪器条件：  
& H% U1 t, u# r" l! B　　色谱柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色谱柱。  
　　流动相：甲醇。  
　　流速：1mL/min。  
　　波长：265nm。  
　　柱温：20℃。  
" |  z* o" X3 c　　灵敏度：0.005AU/MV。  
: k2 ^5 L% z/ Q　　注射体积：50mL。  
　　B) 注射50mL维生素D标准溶液，注射50mL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。  
　　6. 计算
　　ρs×10∕7×40×100  
0 }) p) h. F4 `% A& e0 t1 v. q* O　　X =  
　　m  
( N! M- |# k& H! S　　As  
6 r% @7 p- ?( }( P: x　　ρs= ---×ρsd  
　　Asd  
　　式中： X--样品维生素D的量，mg/100g；  
　　m--称样量，含量，IU∕100g；  
　　ρs --进样液中维生素D有浓度，mg/mL；  
% `* n0 R5 ~" X0 \　　A s --进样液中维生素D有峰高（或峰面积）；  
　　A s d --标样液中维生素D有峰高（或峰面积）；  
2 H* ?6 C: Z3 \: Y3 I; e, U　　ρsd --标样中维生素D的浓度；  
　　计算结果精确至小数点后一位。
+ O6 P% ]' E+ K# a　　7. 注意事项  
　　1) 允许误差及最小检出量：同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10％；最小检出量为0.1国标单位。  
, [. U) d0 i5 O, Y6 w　　2) 试剂焦性没食子酸容易变性，应购习近期生产的试剂。  
　　3) 如果皂化不完全，可适当增加氢氧化钾的加入量。