公共营养师(三级)考点辅导：维生素D的测定方法

会计考友

　　高效液相色谱法
　　1. 原理  
9 i$ c8 M* V4 q' o2 l　　样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱，紫外检测器定量测定。
6 i$ c, I- r! J　　2. 适用范围  
　　本方法来源于GB/T 5413.9-1997。适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定；也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。
1 d& Q- Z0 _0 e9 O' k9 l0 F　　3. 主要仪器  
' A  G* t4 V2 o. }1 B8 }　　1) 高压液相色谱仪，具有可变波长的紫外检测器，数据处理系统或记录仪。  
: e6 P/ Z7 g+ b　　2) 旋转蒸发器。  
! Y3 f  [+ g+ Z! ~# a; [$ `　　3) 平底烧瓶：250mL。
　　4) 分液漏斗：500mL。
0 I" ]+ c0 I& z( S6 |! n7 P* \4 P　　4. 试剂  
　　所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所实验用水均指蒸馏水。
# x; Y) k& N9 v  k2 M, l/ N　　1) 异丙醇：色谱纯。  
　　2) 2％焦性没食子酸乙醇溶液：取2g焦性没食子酸溶液于100mL无水乙醇中。  
　　3) 75％氢氧化钾溶液：取75g氢氧化钾溶于100mL水中。  
　　4) 石油醚：沸程30～60℃。  
; k- r9 H% e0 f2 F  w; d　　5) 甲醇：色谱纯。  
& ^) m  q$ B( l! _　　6) 正己烷：色谱纯。  
7 M7 R# ?) Y- f. k+ J  ?; R　　7) 环己烷:色谱醇。  
2 g; E) v# ?5 O% A　　8) 维生素D标准溶液  
" Q; O/ a) v7 ~& ?. Y- A8 A　　A. 维生素D2标准贮备液：含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。  
　　B. 维生素D3的标准贮备液：含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
+ B  ^/ G2 G1 a　　5. 操作步骤
* [. G" i- ^# J5 E! c　　5.1样品处理：准确称取10g样品，于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。
0 ^. p0 w! D0 ^　　5.2测定液的制备：  
　　1) 于上述样品溶液中加入100mL的20％没食子酸乙醇溶液，充分混匀后加50mL75％氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上边续回流30min后，立刻冷却到室温。  
　　2) 将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。  
　　3) 于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1 min.在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中，重复上棕萃取过程2次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近于（绝不允许蒸干）后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。  
　　4) 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中，用氮气将石油醚吹干，于试管中加1mL正己烷。
　　5.3测定：  
　　1) 测定液的制备：  
2 _  U" z4 {) |. e3 h% g　　A) 仪器条件：  
　　色谱柱：30cm×40cm，硅胶柱。  
　　流动相：正己烷与环己烷按体积比1：1混合，并按体积分数0.8％加入异丙醇。  
6 A& I, s/ c( g! D$ c　　流速：1mL/min。  
　　波长：265nm。  
8 E- o. ]0 E7 w　　柱温：20℃。  
7 M1 t8 J+ @: [) w" A  }/ \1 c　　灵敏度：0.005AU/MV。  
　　注射体积：200mL。  
# L4 i% c: ]2 T4 {　　B) 注射50mL维生素D标样和200mL样品溶液，根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解。  
0 j  M4 O& j2 U4 ^/ c! u　　2) 测定步骤：  
' {9 O9 G9 i# |7 l　　A) 仪器条件：  
+ w4 u- {8 e7 w& ^4 o7 h　　色谱柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色谱柱。  
　　流动相：甲醇。  
6 K, n7 |5 m" N+ l, x* e! {' D　　流速：1mL/min。  
　　波长：265nm。  
　　柱温：20℃。  
　　灵敏度：0.005AU/MV。  
　　注射体积：50mL。  
. _+ B5 w4 Z2 Y, P) ^　　B) 注射50mL维生素D标准溶液，注射50mL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。  
7 X3 L5 w# d- q9 D3 e, [5 z　　6. 计算
* {+ t: J5 R6 ~8 o　　ρs×10∕7×40×100  
6 E& x' W/ D* f　　X =  
　　m  
　　As  
　　ρs= ---×ρsd  
　　Asd  
4 f4 T' a0 c# J. M　　式中： X--样品维生素D的量，mg/100g；  
3 w3 w3 A$ ~  B2 P1 w$ N　　m--称样量，含量，IU∕100g；  
2 W9 U  ^/ R. O7 H% G　　ρs --进样液中维生素D有浓度，mg/mL；  
　　A s --进样液中维生素D有峰高（或峰面积）；  
　　A s d --标样液中维生素D有峰高（或峰面积）；  
　　ρsd --标样中维生素D的浓度；  
  _8 S/ ?& Z0 G" a! \! h　　计算结果精确至小数点后一位。
　　7. 注意事项  
& H7 E7 h$ {1 K  z3 ]  Z$ W" b　　1) 允许误差及最小检出量：同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10％；最小检出量为0.1国标单位。  
　　2) 试剂焦性没食子酸容易变性，应购习近期生产的试剂。  
1 c* G) n4 t# U+ T# P　　3) 如果皂化不完全，可适当增加氢氧化钾的加入量。