传染病学指导：梅毒辅助检查

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　【辅助检查】
　　以往的实验室检查有梅毒螺旋体检查，梅毒血清试验和脑脊液检查。随着基因诊断技术的发展，PCR技术应用检测梅毒螺旋体DNA，使梅毒的诊断变得准确、快速、敏感。
　　一、梅毒螺旋体检查
　　（一）检查方法
　　1．暗视野显微镜检查：在皮损处，用玻片刮取组织渗出液或淋巴结穿刺液，见有活动的梅毒螺旋体。
　　2．免疫荧光染色：在荧光显微镜下可见绿色的梅毒螺旋体。
　　3．活体组织检查梅毒螺旋体，如用银染色法（Warthin-starry）法或（Levoaditis法）或荧光抗体染色，可查见梅毒螺旋体，呈黑褐色，有螺旋结构，位于真皮毛细血管周围。银染色的阳性结果需谨慎解释，因为类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。而特异性荧光检查则更为可靠。
　　（二）螺旋体的鉴别
　　镜下检查梅毒螺旋体与雅司、地方性梅毒、品他三种非性病性螺旋体鉴别，此外还应与齿大螺旋体、齿小螺旋体、软螺旋体、生殖器螺旋体相鉴别。
　　1．雅司、地方性梅毒、品他三种非性病螺旋体：形态上不能与梅毒螺旋体相区别，但流行病学、病史、临床表现可以鉴别；
　　2．齿大螺旋体：为疏螺旋体，比梅毒螺旋体长，存在于口腔中，尤其在齿缝内最多；
　　3．齿小螺旋体：比梅毒螺旋体短，旋距也短，运动不规则，两端较中部略宽。主要见于齿垢中；
　　4．软螺旋体：为疏螺旋体，螺旋较少，运动不规律且快，常不断改变其形态。寄生于皮肤溃疡中。
　　5．生殖器螺旋体：比梅毒螺旋体短小，螺旋体大而不规则，生于阴垢内，不经常清洗者检出率较高。
　　6．其他：与螺旋形网状纤维、纤维蛋白细丝、纤毛、串状红细胞等呈螺旋状的物体相鉴别。
　　二、梅毒血清试验
　　根据所用抗原不同，梅毒血清试验分为以下两大类：
　　（一）非梅毒螺旋体抗原血清试验，用心磷脂作抗原，测定血清中抗心磷脂抗体，亦称反应素。本试验敏感性高而特异性较低，且易发生生物学假阳性。早期梅毒患者经充分治疗后，反应素可以消失，早期未经治疗者到晚期，部分病人中反应素也可以减少或消失。目前一般作为筛选和定量试验，观察疗效，复发及再感染。
　　1．性病研究实验室试验（Venereal Disease Research Laboratory test，VDRL）；用心磷脂、卵磷脂及胆固醇为抗原，可作定量及定性试验，试剂及对照血清已标准化，费用低。此法常用，操作简单，需用显微镜读取结果，缺点是一期梅毒敏感性不高。
          
　　2．快速血浆反应素试验（Rapid Plasma reagin test， RPR）：是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似，优点是肉眼即可读出结果。
　　3．不加热血清反应素玻片试验（Unheated Serum Reagin USR）也是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似。
　　（二）梅毒螺旋体抗原血清试验：用活的或死的梅毒螺旋体或其成分来作抗原测定抗螺旋体抗体。这种试验敏感性和特异性均高，一般用作证实试验。这种试验是检测血清中抗梅毒螺旋体IgG抗体，即使患者经过足够治疗，仍能长期存在，甚至终身不消失，血清反应仍持续存在阳性，因此，不能用于观察疗效。
　　1．荧光梅毒螺旋抗体吸收试验（FTA-ABS Test）：此法是较敏感和较特异的螺旋体试验。
　　2．梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）：敏感性和特异性均高，操作简便，但对一期梅毒不如FTA-ABS试验敏感。
　　3．梅毒螺旋体制动试验（Treponema Pallidum immobilization ，TPI）；用Nichol株螺旋体（活的）加病人血清（含抗体）后，在补体的参与下可抑制螺旋体的活动。如≥50%梅毒螺旋体停止活动，则为阳性。此试验特异性、敏感性均高，但设备要求高，操作难，仅供研究用。
　　三、基因诊断技术检测梅毒螺旋体
　　梅毒螺旋体不能进行体外培养。检测临床标本中梅毒螺旋体最敏感、可靠的方法是兔感染试验（RIT），RIT能证实活的梅毒螺旋体存在，是检测梅毒螺旋体常用的标准方法。然而用RIT对新生儿或成人梅毒进行常规诊断不切合实际。梅毒的血清学诊断对确定感染及治疗很有意义，但对早期梅毒诊断不敏感，对先天性及神经性梅毒的诊断不够特异。血清学试验用作先天性梅毒的辅助诊断，其首要问题是将无症状感染婴儿从非感染婴儿区别开来，这些婴儿的母亲梅毒血清试验阳性，困难在于不能将母亲体液免疫反应同婴儿的抗体反应相区别，因为母亲的IgG可传递给胎儿。另外由于IgG终身存在，所以很难评价治疗结果。血清学诊断常常又存在着假阳性。
　　PCR检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强，敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。
　　（一）PCR引物的设计部位与序列：
　　目前有四套扩增梅毒螺旋体DNA的系统：扩增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），扩增39KDa碱性膜蛋白基因（bmp基因），扩增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和扩增tmpA基因。
　　三种扩增系统的引物序列：
　　47-1???????????? CACAATGCTCACTGAGGATAGT??? 648-669
　　47-2???????????? ACGCACAGAACCGAATTCCTTG??? 1284-1035
　　Tpp47-3? TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC???? 713-734
　　47-4???? TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT??? 1187-1208
　　TP3????? CAGGTAACGGATGCTGAGT?????? 256-275
　　TP4????? CGTGGCAGTAACCGCAGTCT????? 762-741
　　bmpTP5（探针） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519
　　TP7????? CTCAGCACTGCTGAGCGTAG????? 172-191
　　TP8????? AACGCCTCCATCGTCACACC?????? 788-769
　　F1?????? CTCTTCAAGGAGCTCAT???????? 222-206
          
　　Tpf-1F2?? AGACAGTGGTTATGCTC??????? 77-61
　　或tyf-1F3（探针）ATTGCGCCAGCATGTAG?? 114-130
　　F4（探针）ATTGCGCCGGCATGTAG??????? 114-130
　　（二）操作方法
　　1．采集标本，根据病人的情况可采取局部分泌物，抽取淋巴结液，羊水，血清，脑脊液。用适量的蒸馏水稀释，保存于4℃冰箱。
　　2．标本处理：目的是为了暴露梅毒螺旋体的DNA，消除标本对PCR的抑制物。采用下列处理方法。
　　①煮沸法：取10或20μl血清或CSF放入0.5ml微量离心管中，水浴煮10min后在冰浴中冷却，13000g离心10s，上清用作PCR分析。
　　②低速离心法：将100μl羊水，血清或脑脊液加入到900μl无菌磷酸缓冲液中，10000g室温离心10min，上清转入另外的微量离心管中，20000g4℃离心1h，弃上清，沉淀悬浮于50μl 无菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷却，取40μl上清作PCR.
　　③碱裂解法：取收集标本100μl加于含1mol/L NaCl，1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min，用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl（pH8.0）中和。用相同体积的苯酚抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整个600μl的溶液用相同体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，然后用相同体积的异丙醇沉淀（-20℃过液）。13000g4℃离心15min，轻轻倒出上清，凉干。沿淀悬浮于51μl无菌水中，取20μl作PCR模板。
　　（三）PCR扩增
　　1．扩增47KDa膜抗原基因：100ml反应物含：10mmol/L TrisHCl（pH8.3），50mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，100μg/ml明胶，0.5μg引物（47-1和47-2），75mmol/LdNTPs，2.5U TaqDNA聚合酶。取不同量各种制备的DNA作模板，反应过程：94℃15s， 60℃1min， 72℃1min，循环40次，末次循环增加72℃10min延伸时间，取10ml反应物用1% 琼脂糖凝胶电泳分析。点杂交分析产物：取10mlPCR扩增产物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中变性10min，用380μ11.5mol/L NaCl-1mmol/L Tris（pH7.2）中和，然后用Minifold I点膜，80℃真空处理膜2h，用496bp探针65℃杂交过夜。探针为引物47-3和47-4的PCR产物，用随机引物法标记.
　　2．扩增39KDa碱性膜蛋白基因：25μ1反应体系含：1×RT缓冲液，50mmol/L Tris-HCl（pH8.5），50mmol/LNaCl，4mmol/LMgCl2，2mmol/L DTT（二硫基苏糖醇），200μmol/L dNTP，100μmol/L引物（TP7和TP8），0.01%牛血清白蛋白（无DNase和RNase），1UTaqDNA聚合酶，5μ1样品，可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增强PCR.
　　PCR1：先用引物TP7和TP8扩增出617bp片段，反应过程：94℃3min后进入循环过程：94℃1min，65℃1min，72℃1min，循环数为30或35，每一循环中72℃延伸递增5s，最后一次延伸时间延长到6min.
　　PCR2：再用巢居引物TP3和TP4扩增出500bp片段，PCR1产物用蒸馏水稀释10倍，取5μ1用作第二次扩增.PCR2中MgCl2和引物浓度分别为5mmol/L和20μmol/L引物（TP3和TP4），其它条件与PCR1相同。
　　PCR产物分析。①取10μ1反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳；②Southern印迹后，用寡核苷酸探针TP5（以32P作末端标记）杂交。
　　3．扩增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因：100μ1反应物含：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl（pH8.4），2.5mmol/L MgCl2，0.2mg/ml明胶，1μmol/L dNTP，2mmol/L引物（F1和F2），2.5UTaqDNA聚合酶，10μ1经处理的兔睾丸梅毒螺旋体悬液，反应过程：94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 2.5min，循环40次，取10μ1PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹后，用tpf-1特异的探针F3和tyf-1特异物的探针F4分别杂交。
　　为使扩增效率达到最大，反应参数应选择最佳数值。使用大片段双股DNA探针检测PCR产物，而不用合成的寡核苷酸探针，因为这样可通过标记得到较高、特异的放射活性。另外，大片段探针能最大减少野生株tpp47可变序列的假阴性结果及由于Taq DNA聚合酶的错误导致碱基替代的假阴性结果。实验证实：PCR的敏感性确能达到检测单一tpp47拷贝的水平。
　　由于临床标本可能含有大量人细胞和微生物，建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR方法是很重要的。尽管大量数椐支持47Da膜抗原基因及其相应基因具梅毒螺旋体特异性，还应深入研究该方法的特异性。在EB染色的琼脂糖凝胶偶而可见非特异的PCR产物，（如扩增淋病奈氏球菌）时就需要用tpp47特异的探针杂交来增加特异性及敏感性。仅从梅毒螺旋体梅毒亚种和雅司亚种染色体DNA获得了特异的PCR产物，表明了病原性螺旋体非常相近的亲缘关系及47Da免疫蛋白高度保守的抗原性。扩增tpp47不能如常规法那样能区分梅毒螺旋体和伯氏疏螺旋体，在用血清学试验诊断梅毒和莱姆疾病时，这两种螺旋体有交叉反应。
          
　　梅毒螺旋体梅毒亚种 tpf-1基因在123位置为A，雅司亚种tpf-1基因在123位置为G，Noordhoek用tpf-1或tpf-1特异的寡核苷酸探针（两种探针仅一个核苷酸不同）检测不同菌株tpf-1或tpf-1基因的扩增产物。结果表明：不能根据tpf-1或tyf-1基因123位置核苷酸的不同来区别梅毒亚种。这些菌种从梅毒患者分离，一些已用兔传代多次，通过对新鲜临床标本中梅毒螺旋体DNA的分析比较，以上结果可能是由于梅毒螺旋体在传代中点突变所致。
　　四、? 脑脊液检查
　　用于诊断神经性梅毒，包括细胞计数，蛋白量，VDRL试验、PCR检测、胶体金试验等。为除外无症状神经梅毒，所有梅毒病人凡病期超过一年者均应作脑脊液检查。所有早期胎传梅毒婴儿也应检查脑脊液以除外中枢神经系统受累的可能。脑脊液细胞计数和总蛋白量的增加属非特异性变化，脑脊液VDRL试验才是神经梅毒的较可靠诊断依据。但是，当有活动的神经梅毒存在时，脑脊液白细胞计数常增高（WBC>5/mm3），因此，脑脊液白细胞计数也常常是判断疗效的敏感指标。有条件的单位行脑脊液PCR检测，可以快速准确的诊断神经性梅毒。
　　五、? 梅毒血清反应的假阳性
　　技术性假阳性：抗原敏感性过高，血清标本弄错或溶血或细菌污染，检查室技术不熟练。
　　生物学假阳性：非螺旋体抗原血清试验阳性率高于螺旋体抗原血清试验。前者是检测的病人的反应素，后者是检测抗梅毒螺旋体抗体。由于非螺旋体试验所用抗原也存在于其他组织，所以其他疾病甚至偶见正常人也出现反应素，因此在某些疾病中发生阳性反应，针对梅毒而言称为假阳性反应。
　　1．急性生物学假阳性：这些疾病在6个月内转阴。
　　见于麻疹、水痘、风疹、传染性单核细胞增多症、上呼吸道感染、猩红热、亚急性细菌性心内膜炎、肺炎球菌性肺炎、活动性肺结核、丝虫病、斑疹伤寒、锥虫病、回归热、钩端螺旋体、疟疾，但滴度很低，一般在1：8以下，当用螺旋体抗原血清FTA-ABS或TPHA试验检测，血清反应阴性。PCR检测阴性。
　　2．慢性生物学假阳性，可持续6个月以上或数年，甚至终身，可分为两类：
　　（1）非螺旋体抗原血清试验假阳性；这些疾病常见于自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、播散性盘状红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血、进行性系统性硬化症、类风湿性关节炎、风湿性心脏病、肝硬化、结节性多动脉炎、干燥综合征、慢性肾炎及海洛因成瘾，滴度可达1∶64～1∶128；少数孕妇，正常人群假阳性率为1%-2%.在70岁以上高龄老人中有1%出现假阳性。
　　（2）螺旋体抗原血清假阳性；发生率比非螺旋体抗原血清试验少，虽有部分其他病的患者出现FTA-ABS假阳性，其荧光染色常很弱或呈不典型的“串珠状”。
　　（3）梅毒血清反应的假阴性
　　a.一期梅毒硬下疳：一般硬下疳出现2-3周，机体才出现反应素，故早期血清反应常呈阴性。
　　b.感染梅毒立即治疗或晚期梅毒：由于血清反应素低，出现阴性。
　　c.二期梅毒假阴性；不到1%的二期梅毒患者其未稀释的血清VDRL试验呈阴性或弱阳性反应，而在高度稀释后反而为阳性，即前带现象（Prozone phenomenon），这是血清中抗心磷脂抗体过多，抑制阳性反应的结果。
　　d.技术操作或抗原敏感性低出现血清试验阴性。