摘 要：本文采用基因采矿方法从Genebank 中选取四株芽孢杆菌，以PCR 方法扩增了脱氧核糖醛缩酶(DERA)基因，并在E.coli 中实现过量表达。与E.coli K12 DERA(EcoDERA)相比，各种来源于芽孢杆菌的DERA 催化天然底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸(DRP)进行裂解反应的活性接近，但对非磷酸化底物2-脱氧-D-核糖(DR)的催化能力要远大于EcoDERA，且各种酶对两种底物的专一性常数之比([kcat/Km(DR)]/[ kcat/Km(DRP)])均比EcoDERA 高两到三个数量级，在热稳定性上也有明显优势，在70℃仍能保持40-65%的酶活。经活性位点比较发现四种酶底物结合位点具有相似的结构特征，EcoDERA 中Lys172，Phe200，Val206 和Ser239分别在BsuDERA，BliDERA，BamDERA 和BthDERA 中被Phe，Val，Ile 和Arg 全部或部分取代，分析表明这种替换可能影响底物结合位点静电环境变化和两个关键活性位点 Lys残基架构周围的疏水相互作用，因此影响底物专一性。
关键字：生物化学工程；脱氧核糖醛缩酶；基因采矿；底物专一性
0 引 言
天然酶作为高效的生物催化剂已经被广泛用于有机合成过程，研究者们也开发了各种技术以获取具有更高活性或更适底物专一性的酶，但是这些方法都需要从大量突变库中筛选出目标蛋白，因此突变库的多样性及筛选的通量是影响目的酶筛选的关键因素。利用基因采矿可以从海量的测序基因组信息中发现功能蛋白并应用于生物催化中，因此对已知基因组信息进行有效利用及预分析有利于提高筛选新酶的效率。
脱氧核糖醛缩酶，又称2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)因催化两个醛的可逆缩合而受到广泛关注，已被用于合成他汀类药物中间体，肿瘤抑制剂埃博霉素(Epthilone A）以及覆盆子酮前体4-羟基亚苄基丙酮等。其中，来源于E.coli 的EcoDERA由于对磷酸化底物有很强的偏好性而受到广泛关注，但其对非磷酸化的底物如氯乙醛，溴乙醛和叠氮乙醛等的催化效率却很低甚至不发生反应。在有机合成中，一般的底物均为非磷酸化底物，因此需要筛选出适应非磷酸化底物的DERA 并增加热稳定性以提高它们在合成上的应用效率。
现在已知晶体结构的DERA 有10种，通过定向进化和定点突变等手段使人们对其中与催化相关的结构有了更深的理解，而底物专一性相关结构的研究更有助于对其进行改造从而扩大其适应的底物范围。同样，利用这些结构信息及现有的生物信息学工具，人们可以很方便地在基因组数据库中搜索潜在的高性能酶，在对其结构和催化特性进行初步预测后，采用成熟的分子生物学技术对其进行克隆和过表达，作为新功能蛋白开发和改造的候选者。目前已有一些来源于耐高温古细菌Pyrobaculum aerophilum，Aeropyrum pernix 和耐高温细菌Thermotoga maritima，Thermus thermophilus 的具有较高热稳定性或来源环境基因组的高对映体选择性DERA 的报道，通过序列比对发现它们和革兰氏阳性细菌中的DERA 序列相似性较为接近，但和EcoDERA 的同源性却较远。因此本研究从四种已完成全基因组测序的革兰氏阳性芽孢杆菌出发，克隆、表达已预测的DERA，对其底物专一性进行表征，并根据已知的DERA 结构，基于活性位点比较分析这一类结构相近DERA 的特性。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
Quiagen QIAprep Spin Miniprep Kit(Axygen)用于质粒制备，QIAEXII Agarose GelExtraction Kitfaction Kit(Axygen)用于纯化DNA 片段。Primer star DNA 聚合酶购自大连宝生物工程有限公司，限制性内切酶和T4 连接酶购自Fermentas。D-2-脱氧核糖-5-磷酸(DRP)，磷酸丙糖异构酶和甘油磷酸脱氢酶(GPD/TPI) (G-1881)购自Sigma，D-2-脱氧核糖(DR)购自BBI。HisTrap FFcolumns 购自GE 公司。寡核苷酸引物由上海Invitrogen 公司合成，DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司有限公司进行。所有其他的化学试剂均为市售分析纯。
测序仪为ABI PRISM 3730 自动测序仪。UV 检测及酶学测定使用全波长酶标仪Multishan Spectrum RE with cuvette(Thermo scientific)。
1.2 菌株，质粒与培养条件
实验所用菌株及用来设计PCR 引物的同源DERA 及所用引物，所使用和构建的质粒见表2。所有细菌均根据保藏中心所提供的说明进行培养，细菌基因组DNA 由天泽基因组抽提试剂盒从1-2 mL 液体培养液中制备。
克隆过程所用培养基为LBkan30 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，卡那霉素30 μg/mL，pH 7.5；发酵培养基为：蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油5 mL/L，KH2PO4 3.8 g/L 和K2HPO4 12.5 g/L，卡那霉素30 μg/mL。
1.3 方法
1.3.1 基因采矿预测DERA 基因
分别以已报道的耐热和高对映体选择性DERA 序列为对象在ENtrez 基因数据中进行DERA 蛋白检索，从中选取预测有DERA 序列的四种芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis，Bacillus thuringiensis )做为研究对象。
1.3.2 基因克隆及表达
根据种内同源基因为模板进行引物设计，由聚合酶链式反应(PCR)扩增编码DERA 的基因。限制性酶位点NcoI 引入到上游引物起始密码前，限制性酶位点HindIII 引入到下游引物5’末端。PCR 由Primer star DNA 聚合酶进行30 个循环，纯化的PCR 产物先用限制性内切酶消化后插入到预先用同样限制性内切酶消化的pET30a 表达载体上，然后转化到E. coli DH5α 感受态细胞, 并在LBkan30 抗性平板上37℃过夜培养，得到的阳性克隆，提质粒进行基因测序，ORF 正确的表达质粒(如表2)转化感受态表达宿主 E. coli BL21(DE3)，在LBkan30 抗性平板上37℃过夜培养。
挑取单菌落接种到5 mL 发酵培养基中，200 rpm，37℃过夜培养，得到种子液，以2%接种量转接到100 mL 发酵培养基中。当OD600=0.6-0.8，加入IPTG 至终浓度0.5 mM，诱导蛋白表达。诱导6 h 后，在4℃，8000 rpm 离心10 min 收获细胞，细胞储存在-78℃备用。
1.3.3 脱氧核糖醛缩酶的分离纯化
用冰上预冷了的缓冲液A (20 mM 磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 7.5)按10 mL/g 细胞比例重悬融化的细胞团，置于冰水浴中进行超声破碎。破胞结束后，于4℃下离心(12000 r/min, 20 min)去除细胞碎片，所得上清液即为粗酶液。
上清液由0.22 μm 的滤膜(Millipore)过滤，用缓冲液A 平衡镍离子亲和层析柱HisTrapTMFF(GE Healthcare，1mL )，流速1.0 mL/min，将粗酶液上柱(约30 mg 蛋白/mL)，用缓冲液A冲洗10 个柱体积后，用缓冲液B (100 mM 磷酸钠缓冲液，200 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 7.5)洗脱，得到酶液I。用脱盐柱(HiTrap Desalting, Amersham)换置酶液I 中的缓冲液为pH7.5，50mmol的盐酸三乙醇胺。纯化的酶用SDS-PAGE 分析，纯度均在95%以上。酶溶液分装后-78℃保存备用。
1.3.4 动力学及酶活测定
体系为 pH 7.5，195 μl 的50 mmol 三乙醇胺盐酸盐溶液，其中含0.3 mmol 的NADH，浓度范围0.25-40 mmol 的底物(DRP/DR)，GPD/TPI 1.7U/ml，于25℃恒温条件下加入5 μl酶溶液开始反应，检测340 nm 处吸光度的变化。
单位酶活定义：在上述条件下，每分钟裂解1 μmol 底物的所需的酶量。
酶活计算公式：酶活(U)( μmol/min)=Ew×V×106/(6220×L)
比活计算公式：比活(U/mg pr)=酶活(U)/蛋白量(mg)
Ew：1 min 内340 nm 处吸光度的变化；V：反应液的总体积(L)； 6220：NADH 在340nm的摩尔消光系数(L·mol-1·cm-1)；L：光程距离(cm)
1.3.5 热稳定性和最优pH 测定
在热稳定性测定中，将酶液(0.5 mg/mL)在不同的温度保温10 min，然后25℃下测定残余活性。用于酶最适pH 测定的缓冲液是pH 5.0-6.0 的乙酸钠(0.05 M)，pH 6.0-7.5 的咪唑-盐酸(0.05 M), pH 7.5-8.5 的三乙醇胺-盐酸和pH 8.5-11.0 的甘氨酸-氢氧化钠。用于测定的反应为DRP 裂解反应。
1.3.6 蛋白质含量测定
蛋白质的含量采用Bradford 法进行测定, 以牛血清蛋白做标准。
1.3.7 序列分析
序列比对及进化树构建所用软件为ClustalW2。
2 结果与讨论
2.1 脱氧核糖醛缩酶的克隆表达及序列比较
从已测序细菌基因组信息出发进行脱氧核糖醛缩酶醛缩酶的基因采矿，选取4 株芽孢杆菌，进行DERA 的克隆与表达，测序后将其于Genebank 中进行BLAST分析，其中BliDERA(Bacillus licheniformis ATCC 14580 ，NC_006270) 与所报道测得序列一致，BamDERA，BthDERA，BsuDERA 与种内不同菌株间的核酸和蛋白序列有差异，BLAST 后显著比对结果其序列提交至GenBank 的accession number 。同时也将和EcoDERA(Escherichia coli K12 NC_010473)克隆表达与其进行比较。来源于四株革兰氏阳性菌的DERA 的蛋白序列相似性在73%-86%之间，但是它们和来自E.coli 的DERA 同源性较差，蛋白相似性在31-39%。由ClustalW2 构建的系统进化树。
2.2 温度及pH 对脱氧核糖醛缩酶的影响
通过对 DERA 热稳定性的考察发现，四种来源于芽孢杆菌的DERA 比EcoDERA 的热稳定性要高，它们在70℃仍然保持40~65%的活性，尤其是在100℃下加热10 min 后，BthDERA 能保持41%的活性，BamDERA 能保持57%的活性，相比较而言EcoDERA 在大于60℃时活性便显著降低。结果表明与EcoDERA 相比，这四种DERA 作为生物催化剂在有机合成中有更高的潜力。四种DERA 催化DRP 裂解反应的最优pH 都集中于中性偏碱的pH 范围内。除BliDERA 的最优pH 在8.5，其余三个酶和EcoDERA 相同，最优pH 均为7.5。四种酶在pH 小于5 时都明显沉淀，且在pH 小于5.5 和大于10.0 时酶活性都明显降低。
2.3 各种DERA 对DRP 和DR 的催化效率比较
研究发现四种来源于芽孢杆菌的DERA 对非磷酸化底物的反应速率要高于EcoDERA，为了比较它们对两种底物催化效率的差异，本文进行了酶促反应的动力学研究(表4)。从Km值可以看出BliDERA，BamDERA，BthDERA 和BsuDERA 对DR 的亲和力远高于EcoDERA。且它们对非磷酸化底物DR 的催化效率明显优于EcoDERA，专一性常数kcat/Km(DR)比EcoDERA 要高一到三个数量级。比较四个酶对两种底物的专一性常数之比[kcat/Km(DR)]/[kcat/Km(DRP)]，均比EcoDERA高两到三个数量级，得出四个芽孢杆菌DERA对非磷酸化底物DR 的专一性明显高于EcoDERA。
2.4 结构与底物专一性分析
EcoDERA 中涉及到形成Schiff 碱调节羟醛缩合反应的关键残基(Cys47, Asp102, Lys167和Lys201)在四个克隆的芽孢杆菌DERA 中完全保守。在这些残基中，两个Lys 残基在DERA 的反应机制中起着关键的作用。Lys167 和底物形成Schiff 碱，而接近Lys167的Lys201 会对Lys167 的pKa 值产生影响，并且涉及到供体醛的立体选择性去质子化过程。而对不同底物的亲和力及催化效率取决于底物结合位点。Wong等人报道了EcoDERA 磷酸结合活性位点由氨基酸残基Gly171, Lys172, Gly204, Gly205, Val206, Arg207, Gly236, Ser238与 Ser239 组成。然而只有侧链Ser238 与DRP 的磷酸部分形成直接的氢键。
EcoDERA 中组成磷酸结合袋子的大部分残基在四个克隆的DERA 中是保守的，在BsuDERA，BliDERA 和BamDERA 中Lys172，Val206 和Ser239 分别被Phe，Ile 和Arg 取代，在BthDERA 中Lys172 和Ser239 分别被Phe和Arg取代。因此推测这些差异性导致了所克隆酶在底物特异性上的差异。根据利用改变酶活性位点的静电环境与非天然底物的静电环境互补从而改变底物专一性的研究，推测Lys172被Phe 取代导致了底物结合袋子整体静电环境的变化，并且Val206 和Ser239 的取代会引起磷酸结合袋子结构上的改变。而Ser239 变为侧链更长的碱性氨基酸Arg，对带负电的天然底物DRP 亲和力没有下降，却对显电中性的非天然底物DR 的活性比EcoDERA 强，表明Ser239 变为Arg 并没有使磷酸结合袋子的静点环境正电性增加，由此推测Ser239 可能不对磷酸结合位点的静电环境起主要作用。
令人欣慰的是，现有对DERA 底物结合位点的认识并不只局限于EcoDERA，本研究与Sakuraba等人基于嗜热DERAs 对EcoDERA 的叠加来预测的DRP 结合位点所得到结果相似，在PaeDREA 中Lys172，Val206 和Ser239 分别被Phe，Ile 和Thr 取代。在TmaDERA中，Lys172，Val206 分别被Phe，Ile取代。且Jennewein 等人报道的DERA 突变体中Phe200被替代成Ile，它在催化非生理受体底物氯乙醛和两个乙醛的连续羟醛缩合反应活性上比野生型提高了14倍。Sakuraba 推测在两个嗜热DERA 中Phe200 都被替换成了Val 的取代也许会影响两个关键Lys 残基架构周围的疏水相互作用，而在所克隆DERA 中都出现了同样的取代，这可能解释了所克隆DERA 对DR 的相对强的亲和力，当然还需要进一步进行结构模拟及测定来解释与不同底物专一性相关的结构特征。
3 结 论
本研究利用基因采矿方法从基因组数据库中选取四种芽孢杆菌，克隆表达并纯化了其中脱氧核糖醛缩酶，在进行热稳定性，最优pH 和酶学性质测定后，与来源于大肠杆菌的脱氧核糖醛缩酶(EcoDERA)做结构比较。四种酶在热稳定性上比EcoDERA 具有优势，并且四种芽孢杆菌DERA 都更易接受非磷酸化底物2-脱氧-D-核糖(DR)，且有较高的催化效率。结构分析发现它们存在相似的序列特征，EcoDERA 磷酸结合袋子中可能影响其静电环境、疏水作用和结构的残基Lys172，Phe200，Val206 和Ser239 在所克隆的四种DERA 中分别得到全部或部分取代(Lys172Phe，Phe200Ile，Val206Ile，Ser239Thr)，结合其他一些耐热菌DERA序列和结构研究，推测该结构是DERA 对非磷酸化底物有较强亲和力的特征。因此，在这些有着较优越非磷酸化底物亲和力的DERA 基础上进行改造有望获得具有更高底物专一性的酶，而且它们相对较好的热稳定性在实际应用中也具有明显的优势。基于四种DERA 的同源性大于70%，可以作为模板进行DNA 家族改组实现该酶对非磷酸化底物的催化效率及热稳定性的共同进化，并进一步拓展它在有机合成中的应用。来源:???www.utlunwen.com |
发表于 2012-8-21 21:36:33
