临床检验技师考试综合辅导资料：超敏反应的主要免疫学检测

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　　四种类型超敏反应发生的机制不同，同一抗原也可在不同条件下引起不同类型的超敏反应。四种类型超敏反应的免疫检测方法有所不同。Ⅰ型超敏反应主要检测过敏原和测定血清特异性IgE.Ⅱ型超敏反应的检测重点是抗血细胞抗体。Ⅲ型超敏反应主要检测循环免疫复合物。Ⅳ型超敏反应可用皮肤试验来检测。
　　一、过敏原皮肤试验
　　皮肤试验简称皮试，是在皮肤上进行的体内免疫学试验。当试验抗原进入致敏者皮肤时，皮肤中结合有IgE的肥大细胞或致敏T细胞就会与试验抗原结合，引发即刻型或迟发型的皮肤超敏反应。试验抗原也可从注射部位进入微血管，与循环中的相应抗体结合，形成的免疫复合物可在局部沉积，激活补体引起炎症。所以皮肤试验主要用于检测Ⅰ型和Ⅳ型变态反应，有时也用于检测Ⅲ型变态反应。
　　（一）试验准备
　　首先应当制备试验用抗原，如有合格商品可直接购买。可以作为变应原的物质种类繁多，例如动物皮毛、家禽羽毛、鸽粪、昆虫、螨类、真菌、花粉、杂草、物理粉尘和各种食品等都可能成为变应原。
　　不同抗原的制备方法不同，但一般包括以下几个步骤：①收集原料；②粉碎与匀浆；③脱脂与提取；④过滤与分离；⑤分装保存。分装保存之前应对提取产物进行鉴定。首先必须经过无菌试验、急性毒性试验和热原检查，保证提取产物无明显的毒副作用；还要测定产物的蛋白含量，用凯氏定氮法或磷钨酸沉淀法标定出总氮单位或蛋白氮单位。
　　试验部位应清洗干净，严格消毒，以免皮肤的不洁物引起非特异性反应或感染。当皮肤患湿疹、感染、皮炎或外伤时不宜进行皮肤试验。正在或近日服用免疫抑制剂或抗组胺药物者也不宜进行皮肤试验。
　　（二）试验类型及方法
　　皮肤试验的最常用部位是前臂屈侧，因此处皮肤较为光滑细腻，而且便于试验操作和结果观察。按正规作法，左右两臂一侧作试验，另一侧作对照。需要时也可选用上臂或背部皮肤。具体试验方法可分为皮内试验、挑刺试验和斑贴试验。
　　1.皮内试验：将试验抗原与对照液各0.0l～0.03ml用皮试针头分别注入皮内（不是皮下），使局部产生一个圆形小丘。当同时试验多种抗原时，相互间至少间隔2.5～5cm，以免强烈反应时互相混淆结果。
　　皮内试验的敏感性比其他皮肤试验高，所用抗原应适当稀释，以免出现严重反应；当高可疑性抗原出现阴性结果时，应逐渐加大抗原浓度进行重复试验。
　　皮内试验是最常用的皮肤试验。应用范围也很广，几乎各类抗原及各型反应都可用皮内试验进行测定，只是不同类型的反应观察结果的时间和判定结果的标准有所不同。
          
　　2.挑刺试验：也称点刺试验或刺痕试验。将试验抗原与对照液分别滴于试验部位皮肤上，用针尖透过液滴或在皮肤上轻轻地挑刺一下，以刺破皮肤但以不出血为度；1min后拭（吸）去抗原溶液。同时试验多种抗原时，千万注意不要将不同的抗原液交叉混合，以免出现假阳性。
　　挑刺试验主要用于Ⅰ型变态反应，该法虽比皮内试验法敏感性稍低，但假阳性较少，与临床及其他试验的相关性较强。
　　划痕试验是挑刺试验的一个变型，用三棱针或注射器针头在皮肤划一条或多条约lcm长的创痕。因为划痕的轻重与长短难于掌握一致，故不常用。
　　3.斑贴试验：将试验抗原直接贴敷于皮肤表面的方法。主要用于寻找接触性皮炎过敏原。试验抗原为软膏时可直接涂沫在皮肤上；如为固体物时可用蒸馏水混合或浸湿后涂敷于皮上；如为水溶液则浸湿纱布后敷贴于皮肤上。所用抗原浓度以不刺激皮肤为原则，涂敷范围以0.5～1cm为宜。涂敷后盖以油纸或玻璃纸，用纱布或绷带固定；如有明显不适感可随时打开查看，并进行适当处理。斑贴试验主要是检测Ⅳ型变态反应，敏感程度虽然不太高，但假阳性较少，结果的可信度大。
　　（三）结果判定及分析
　　1.Ⅰ型变态反应在抗原刺激后20～30min内观察结果。挑刺试验的阳性反应以红晕为主，皮内试验的阳性反应则以风团为主，判定标准见有关文献。
　　2.IV型变态反应在接触抗原后24～72h内观察结果。皮内试验的阳性结果以红肿和硬结为主，斑贴试验的阳性结果以红肿和水疱为主。判定标准见有关文献。有时候，机体对某变应原可能同时存在多种类型的反应。例如在做青霉素皮内试验时，30min内观察呈阴性反应，但在5～8h可能会出现Ⅲ型变态反应，反应的外观现象介于Ⅰ型与Ⅳ型变态反应之间；甚至还可能出现型变态反应。
　　3.假性结果：在一定条件下，皮肤反应的结果可能与机体的实际情况不符，即出现假阳性或假阴性等不真实的结果。
　　出现假阴性的常见原因有：①试验抗原的浓度过低，或者因各种原因失效；②试验时正确服用免疫抑制剂或抗组胺药物（后者可通过设立组胺阳性对照而判断出来）；③操作误差，例如皮内试验时注射过深进入皮下，注入抗原量过少等；④皮试季节选择不当，例如花粉季节过后，抗花粉抗体水平可下降。
　　出现假阳性的常见原因有：①试验抗原不纯，在提取、配制，甚至在试验过程中被其他抗原污染，引起交叉反应；②试验溶液配制不当，过酸或过碱都会对皮肤产生非特异性刺激；③皮肤反应性过强，例如被试者患有皮肤划痕症，或者有既往过敏的痕迹等；④操作不当，例如注入少量空气也可出现假阳性。
　　（四）应用与评价
　　皮肤试验属于活体试验，虽然影响因素众多，却能反应机体各种因素综合作用的实际免疫状态；并且简单易行，结果的可信度大；这些优点是其他方法难以替代的，所以在临床和防疫工作中都经常应用。
　　1.寻找变应原：变态反应防治的重要原则之一是回避变应原，而回避的前提是明确变应原。确定变应原的常用方法是各种类型的皮肤试验。例如支气管哮喘和荨麻疹等均可用皮肤试验来帮助诊断。但食物过敏与皮肤试验的相关性较差，这可能是因为食物的抗原提取液与肠吸收的物质有所不同，或食物过敏并非IgE所介导；而且食物过敏的变应原容易发现，一般不必作皮肤试验。
          
　　2.对患者首次注射某批号的青霉素、链霉素预防药物或疫苗过敏或其他易过敏药物之前，必须做过敏试验；如果患者呈阳性反应（即使是可疑阳性），就应更换其他抗生素。注射异种抗血清（例如抗破伤风血清和抗狂犬病血清）前也必须做过敏试验，如果呈阳性反应就需要换用精制抗体；或进行脱敏治疗（少量多次注射，使抗原逐渐中和血液中的抗体）。
　　3.评价宿主细胞免疫状态：在可疑免疫缺陷病、肿瘤或器官移植时，了解患者的细胞免疫状态对疾病诊断和预后判断都有重要意义。这种情况下可以使用共用抗原结核菌素（OT或PPD）或双链酶（SD-SK）进行皮肤试验；或使用人工合成的二硝基氯苯（DNCB）或二硝基氟苯（DNFB）等先进行致敏再作皮肤试验，这样可消除抗原接触史不同所致的误差。
　　4.传染病的诊断：对某些可疑的传染病，用某种病原体的特异性抗原进行皮肤试验可以起到诊断或鉴别诊断的作用。例如对布氏菌病和软下疳等细菌感染、对某些病毒感染和真菌感染、以及某些寄生虫感染均有一定的意义。
　　另外，还有一些反应机制不同于变态反应的中和性皮肤试验，例如诊断白喉的锡克试验和诊断猩红热的狄克（Dick）试验等。
　　二、血清lgE的检测
　　IgE是介导Ⅰ型变态反应的抗体，因此检测血清总IgE和特异性IgE对Ⅰ型变态反应的诊断和过敏原的确定很有价值。
　　（一）血清总IgE的测定
　　正常情况下血清IgE仅在ng／ml水平，用常规测定IgG或IgM的凝胶扩散法检测不出IgE，必须用高度敏感的放射免疫测定法及酶联免疫测定法和化学发光法等进行检测。
　　1.放射免疫吸附试验（IRST）：是将抗IgE吸附到固相载体上用以检测血清IgE的方法，故又称固相放射免疫测定（SPRIA）。临床常用双抗体夹心法，多以滤纸为载体。将抗IgE抗体偶联到经溴化氰活化的滤纸上，使其与待检血清及IgE参考标准进行反应；洗涤后加入125I标记的抗人IgE，再经洗涤后测定滤纸片的放射活性，其测定值与标本中的IgE含量呈正相关。
　　2.酶联免疫测定法：测定血清IgE时也常用双抗体夹心ELISA法，操作方便，敏感性也很高，在临床上经常应用。
　　3.间接血凝试验：用抗IgE致敏红细胞，将标本血清做系列稀释后与致敏红细胞反应。此法更加简便易行，便于普及，但敏感性比上两法稍低。
　　4.化学发光法：用化学发光物质标记抗IgE，与血清中的IgE反应后，通过化学发光分析，计算出IgE含量。此法敏感性特异性均较好。
　　（二）特异性IgE的测定
　　过敏患者的血清中存在着具有变应原特异性的IgE称之为特异性IgE，如对牛奶过敏者则有针对牛奶变应原的IgE；对蒿草花粉过敏者，则有针对该花粉的IgE，该抗体只能与该变应原特异性结合。因此需要用纯化的变应原代替抗IgE进行检测。
　　sIgE检测方法有许多种，目前临床上常用的有ELISA，FEIA，免疫印迹等。随着sIgE测定技术的完善，此项测定已日趋商品化，开发了各种检测系统，如CAP过敏原检测系统，Master过敏原检测系统，Px过敏原检测系统等，这些测定系统包括了仪器、试剂、计算机软件处理系统。国内目前应用最多的是CAP检测系统。
　　1.放射变应原吸附试验（RAST）：将纯化的变应原与固相载体结合，加入待检血清及参考对照，再与同位素标记的抗IgE抗体反应，然后测定固相的放射活性，通过标准曲线求出待检血清中特异性IgE的含量，或在标本放射活性高于正常人均数加3s时判为阳性。
　　2.酶联免疫测定法试验：原理及步骤基本同RAST，仅是最后加入酶标记的抗IgE，利用酶底物进行显色。测定结果的表示也与RAST相同。
　　3.CAP检测系统：CAP，一个很小的塑料帽状物，其内置有多孔性、弹性和亲水性的纤维素粒，此粒多孔，吸咐了更多的变应原，加人血清，血清中的sIgE就会和变应原结合，再加入酶标抗人IgE，再加入荧光显色系统，在荧光分光光度计上测定荧光强度，计算机提供相应软件，自动计算出结果。报告sIgE含量。
          
　　（三）临床意义
　　1.血清总IgE：血清总IgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示，1IU=2.4ng，相当于WH0标准冻干血清制剂0.00928mg内所含的IgE量。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐带血IgE水平小于0.5IU／ml，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。成人血清IgE水平约在20～200IU／ml之间，一般认为大于333IU／ml（800ng／ml）时为异常升高。
　　与IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。上述疾病时IgE升高的程度并不一致，在过敏性支气管肺曲菌病时最为显著，其值可达5000～20000ng／ml，除了此病和特应性皮炎以及在花粉季节之外，任何血清总IgE水平大于5000ng／ml的患者均应考虑寄生虫感染的可能性。
　　2.特异性IgE：slgE测定是体外检测变应原的重要手段。主要用于Ⅰ型超敏反应的诊断。其试验的灵敏度及特异性都很高、特别是对花粉、螨类、宠物皮屑、牛奶、鸡蛋、坚果等变应原的sIgE测定，灵敏度和特异性都在90%以上，有的甚至接近l00%.根据sIgE含量可确定患者变应原种类，可评价患者过敏状态，脱敏治疗的疗效，对哮喘的诊断和鉴别诊断有重要帮助。
　　RAST（放射变应原吸附试验）是目前公认的检测Ⅰ型变态反应的有效方法之一，具有特异性强、敏感性高、影响因素少、对患者绝对安全等优点；不但有助于过敏性哮喘的诊断，对寻找变应原也有重要价值。RAST与皮肤试验和支气管激发试验的符合率在80%左右，但不能完全代替后两种试验，因为活体试验还能反映嗜碱性粒细胞和靶细胞的反应性。
　　但是RAST也有许多缺点：费用昂贵、花费时间长、放射性同位素易过期而且污染环境、不同来源试剂盒的参比血清不同而不易相互比较、待检血清含有相同特异性IgG时可干扰正常结果。目前国内应用较少。
　　因此一般只在下列情况下才做RAST：①皮试结果难以肯定，但需提供进一步的诊断证据者；②不适宜做皮试或激发试验者，例如老年、幼儿、妊娠妇女、患有皮肤病、对变应原有严重过敏史或正服用抗过敏药物以及重病者；③观察脱敏治疗效果或研究变态反应机制。
　　ELISA法与RAST有相似的优点，而且还有独特的长处，如没有同位素污染、酶标抗体可长期保存，因此在国内应用较多。用ELISA测试屋尘和一些花粉的结果与RAST符合率较高，且与临床也较符合，但与皮肤试验的符合率可能不够理想。
　　CAP吸咐变应原有单价，有多价，如多价霉菌，多价食物（Fx5E，含6种食物过敏原），多价羽毛等，多价变应原阳性后，再进一步确定单个变应原成分。目前国内应用较多。
　　三、抗血细胞抗体的检测
　　血细胞抗体是Ⅱ型变态反应的主要介质，检测抗血细胞抗体对Ⅱ型变态反应的诊断有重要的意义，具体方法和临床分析参见临床血液学和临床基础检验学以及凝集反应等有关章节。主要包括Rh抗体检测、抗红细胞、血小板、白细胞等。
　　四、循环免疫复合物的检测
　　Ⅲ型超敏反应的发生主要是由循环免疫复合物（CIC）引起，通过检测CIC可以证实某些疾病是否与Ⅲ型超敏反应有关，也可帮助分析判断疾病的进程及转归。
　　（一）抗原特异性免疫复合物的检测
　　抗原特异性免疫复合物的检测是通过检测免疫复合物中抗原特异性来检测CIC.优点是特异性高，通过检测可以了解引起免疫复合物病的抗原。但在大多数情况下，免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂，所以抗原特异性方法并不常用。
          
　　（二）抗原非特异性免疫复合物的检测
　　抗原非特异性免疫复合物的检测仅是检测血清中循环免疫复合物，方法很多。
　　（三）临床意义
　　判定免疫复合物为发病机制的证据有三：①病变局部有IC沉积；②CIC水平显著升高；③明确IC中的抗原性质。第三条证据有时很难查到，但至少要具备前两条，单独CIC的测定不足为凭。人体在健康状态下也存在少量的CIC（大约l0～20μg／ml），其生理与病理的界限不易区分。另外，CIC检测的方法太多，其原理各不相同，用一种方法测定为阳性，另一种方法检测可能为阴性；但与免疫组化法一起检测，其意义就大得多。
　　目前已经明确系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、部分肾小球肾炎和血管炎等疾病为免疫复合物病，CIC检测对这些疾病仍是一种辅助诊断指标，对判断疾病活动和治疗效果也有一定意义。在发现紫癜、关节痛、蛋白尿、血管炎和浆膜炎等情况时，可考虑免疫复合物病的可能性，进行CIC和组织沉积IC的检测。另外，患有恶性肿瘤时CIC检出率也增高，但不出现Ⅲ型变态反应的损伤症状，称之为临床隐匿的IC病，然而这种状态常与肿瘤的病情和预后相关。
　　五、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数
　　（一）嗜酸性粒细胞计数
　　嗜酸性粒细胞参与Ⅰ型变态反应，因此嗜酸性粒细胞增多可作为Ⅰ型变态反应的辅助诊断指标，而且可作为疗效判定的指标之一。
　　嗜酸性粒细胞计数可用白细胞分类计数法，也可以用直接计数法，目前多采用后者。该类细胞的胞浆颗粒中富含碱性氨基酸和碱性蛋白，其等电点为pH11，因此呈嗜酸性，易与阴离子结合而被染色。常用的染色液含伊红、石炭酸和福尔马林，该溶液可溶解红细胞和其他白细胞，增加背景的清晰度，使嗜酸性粒细胞易于识别。
　　（二）嗜碱性粒细胞计数
　　嗜碱性粒细胞亦参与Ⅰ型变态反应，其计数方法主要是直接计数法。嗜碱性粒细胞胞浆颗粒中肝素的硫酸根容易与阳离子染料结合而着色，现在常用的酸性染色液包括0.1íTA、阿利新蓝、氯代十六烷基吡啶和氯化镧等。该染液能使红细胞和其他白细胞溶解，使嗜酸性粒细胞易于区别。外周血嗜碱性粒细胞数大于33／μl判为增高，大于50／μl为显著增高。本试验可作为Ⅰ型变态反应的筛选试验，阳性率可达60%～70%；而且可作为疗效考查的辅助指标。