临床检验技师考试综合辅导资料：双试剂苦味酸法测定血清肌酐的改进

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碱性苦味酸速率法测定的原理是肌酐同碱性苦味酸反应形成一种红色复合物，通常在510nm处根据测定一定时间内血清和标准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在510nm处也有较强光吸收，并且在氢氧化钠的作用下，逐渐转化为620nm处有强光吸收的胆绿素，而胆绿素在520nm处只有很弱的光吸收，这样就掩盖了肌酐本身的显色反应的表现，从而使测定结果偏低，甚至出现负值。
经过查阅有关文献和多次实验，发现胆红素在37℃和强碱环境下被氧化成胆绿素，导致510nm处吸光度减少的时间为两者混合后50s以内，50s以后510nm吸光度下降缓慢或基本不变。我们根据这一发现并结合BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪的特点，将原来的双液体试剂反应步骤进行了改进，把原来的一步法改为两步法。这种改进后的方法可以有效地消除胆红素对肌酐测定的负影响。
1材料与方法
1.1试剂碱性苦味酸试剂
由上海丰汇医学科技公司提供。肌酐标准液、高、中、低定值质控血清：美国进口。仪器：BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪。
1.2方法
20l血清与200l试剂R1混合后，连续检测该混合物分别在520nm和620nm处吸光度的变化。结果发现48s以后520nm吸光度下降缓慢或基本不变，而620nm处吸光度在32s后上升缓慢或基本不变。胆红素被氧化成胆绿素的反应主要发生在标本和RI液混合后50s以内。
根据上述发现并结合BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪的特点，调整后的反应参数。20l血清与200l试剂R1反应16s后加入50l试剂R2，在试剂R2加入后16s读取起始吸光度，再过48s读取终末吸光度，计算时用A2-A1=A，肌酐的含量为：肌酐=样品A/标准A标准浓度。主波长520nm，副波长560nm，反应温度37℃。
          
2结果
2.1两种方法的比较选取胆红素和肌酐正常参考值范围的低值定值质控血清，分别用一步法和两步法在BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪各连续测定测定肌酐浓度20次，一步法测定结果：x=45.8mol/L，s=2.231，CV=4.9%；两步法测定结果x=47.0mol/L，s=2.066，CV=4.4%.经配对t检验，t=1.9880.05，两者无明显差异，并且二者测定结果都接近靶值。再取一定量的高值定值质控血清，在BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪分别用一步法和两步法连续测定肌酐20天。一步法测定结果由于受胆红素的影响，肌酐浓度明显降低。而两步法胆红素对其影响不大与质控血清肌酐定值接近。配对t检验，t=8.37t，P＜0.05，两者有明显差异。
2.2方法的精确性
本方法低、中、高三种质控血清批内变异系数依次为4.8%、2.94%、0.84%，批间CV依次为3.79%、2.06%、1.52%，精密度良好。
2.3回收实验
取3份胆红素在117mol/L的血清做试验，分别加入肌酐的浓度为40.9mol/L、20.3mol/L、10.6mol/L做肌酐测定回收试验，测得回收浓度分别为38.9mol/L、19.3mol/L、10.7mol/L回收率依次为95.1%、95.2%、103.8%.3讨论苦味酸速率法测定肌酐时，受高胆红素负干扰而致结果明显偏低，甚至出现负值。常用消除干扰方法有强碱法、表面活性剂法、氧化剂法、胆红素氧化酶法、补偿修饰、在部分机型上应用速率B法。
预处理法，由于添加了其他成分，操作不可避免地显得冗长、繁琐，另一方面因为附加成分的介入，破坏了原有反应体系，可能又会引起新的干扰。速率B法对仪器要求高而难以普及应用。而酶法测定肌酐由于价格的关系，目前只被国内少数医院接受，难以普及。本方法没有添加任何成分，原有的反应体系没有改变，所以方法学评价和原方法一致，并且可以有效地消除胆红素对肌酐测定的干扰，对胆红素400mol/L的标本用生理盐水稀释1倍进行测试效果较好。该方法简单、方便、准确，适合临床推广。