免疫检验考试辅导：抗血清的制备

会计考友

　　一、动物的选择
　　选择合适的动物进行免疫极为重要。选择时应考虑以直几个因素：①抗原与免疫动物的种属差异越远越好；亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔－大鼠之间，鸡－鸭之间）。②抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家兔或豚鼠即可。③抗血清的要求：抗血清可分为R型和H型。H型抗血清用于沉淀反应较难掌握，因而极少应用。④抗原的选择：对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔。但是，在某些动物体内有类似的物质或其它原因，对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类（如胃蛋白酶原等）对山羊等，免疫时皆不易出现抗体。这些物质有时可以用豚鼠（如胰岛素等）、火鸡、甚至猪、狗、猫等作试验免疫。⑤甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。
　　二、免疫剂量、时间和途径
　　免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。抗原需可量多，时间间隔长，剂量可适当加大。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5～1mg/只，小动物约0.1～0.6mg/只。有时主观希望加强免疫效果而不适当地加大剂量，往往会弄巧成拙。因为剂量加大极易造成免疫耐受（免疫抑制）而遭失败。已有证明，几微克的蛋白质也能很好地免疫出抗血清。
　　免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利。但皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入（因佐剂加入后粘度较大）。其他途径还有肌内、腹腔、静脉、脑内等，但较少应用。如抗原极为宝贵可采用淋巴结内微量注射法，抗原只需10～100μg；方法是先用不完全佐剂在足作基础免疫（预免疫），10～15天后可见肘窝处有肿大的淋巴结（有时在腹股沟处触及），用两手指固定好淋巴结，消毒后用微量注射器直接注射入抗原（一般不需要佐剂）。
　　免疫间隔时间也是重要因素，特别是首次与第二次之间更应注意。第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。对于半抗原的免疫间隔则要求较长，有的报告1个月，有的长达40～50天，这是因为半抗原是小分子，难以刺激机体发生免疫反应之故。免疫的总次数多，多为5～8次。如为蛋白质抗原，第八次免疫未获得抗体，可在30～50天后再追加免疫一次；如仍不产生抗体，则应更换动物。半抗原需经长时间的免疫才能产生高效价抗体，有时总时间为一年以上。
          
　　三、动物采血法
　　动物免疫3～5天后，如抗血清鉴定合格（见下节），应在末次免疫后5～7天及时采血，否则抗体将会下降。因故未及时取血，则应补充免疫一次（肌肉、腹腔或静脉内注射，不加佐剂），过5～7天取血。
　　1．颈动脉放血法这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。在动物颈外侧做皮肤切口，拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌，将此肌钝性分离并推向后方，即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离（连同与之同行的迷走神经），用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，另一止血钳夹住动脉迷走神经，用以固定。沿结扎处剪断血管，用固定止血钳将断端放入瓶口，慢慢打开夹持的止血钳，动脉血立即喷射入瓶。如此放血的速度快，动物死亡也快，取血量略少于其他放血法。如在放血大约总量的一半时，暂时将动脉夹住片刻，再继续放血，得血量可以多些。
　　另外一种慢放血法是在动脉内插入一采血器，用闭式放血。在颈动脉内插入一较粗的玻璃管，将血管与玻璃管用线扎牢，玻璃管接一橡皮管引血入瓶，也极为方便。
　　2．心脏采血法此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。
　　3．静脉多次采血法家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法，一只家兔可采百余毫升血液（用颈动脉放血最多可获70～80ml，一般只有50ml左右）。用颈静脉采集绵羊血，一次可放300ml，放血后立即回输10％葡萄糖盐水，三天后仍可采血200～300ml。动物休息一周，再加强免疫一次，又可采血二次。如此，一只羊可获1500～2000ml血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超过2ml。
　　抗血清的分离多采用室温自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝块收缩。前者迅速，但得血清较少；后者时间长，有时还会出现溶血，但获得血清多，而且效价不会下跌。
　　抗血清分出后是否要经56℃30min灭活有两种不同意见。一种认为血清中有许多活性酶，特别是球蛋白的降解酶，如不清除，血清存放过程中将导致抗体效价下降。另外的意见认为，这种自然降解是微不足道的，56加温后，有些球蛋白会发生热变性或者热聚合。含这种聚合大分子蛋白的抗血清用于免疫浊度试验时，可因沉淀剂（如PEG）的加入而发生假性混浊。